L'analyse préalable

Avant un DPI, une analyse préalable est effectuée dans la famille demandeuse afin de s’assurer de la faisabilité du test sur cellule unique, que l’on retrouve effectivement la mutation recherchée, que les marqueurs sont bien informatifs, qu’il n’y ait pas d’inversion d’échantillons des individus. C’est pour cela que parfois il sera nécessaire de prélever aussi les parents des deux conjoints, ou seulement celui qui est porteur de la maladie, ou bien encore de se procurer de l’ADN des enfants du couple. Plusieurs stratégies sont envisageables selon le cas de figure de la famille à étudier : soit la mutation est connue et techniquement identifiable et on fera une analyse directe ; soit la mutation est connue et non exploitable ou bien n’est pas connue et on effectue une analyse indirecte. Aujourd’hui l’analyse indirecte est utilisée pratiquement systématiquement conjointement à la détection de la mutation recherchée, grâce à des techniques de PCR plus puissantes pour augmenter la fiabilité du diagnostic. Une fois cette analyse préalable effectuée, on pourra lors du DPI déduire le statut des embryons en fonction des allèles reçus, ou de la présence d’une mutation. En général, lors de cette analyse préalable on va calculer le pourcentage d’allèle drop-out en amplifiant une grande quantité de cellules contenant la mutation et/ou hétérozygote pour les marqueurs. Ces cellules doivent forcément être hétérozygotes sinon il y aurait toujours un des allèles caché par l’autre.

L’analyse directe

Les analyses directes peuvent différer selon le type de mutation. En général sont étudiées en DPI :

· les délétions

· les insertions

· les mutations ponctuelles

· les expansions de triplets

Les analyses directes sont faites en PCR et étudiées selon des techniques qui varient en fonction de la nature de la mutation à étudier.

Principe

Les fragments d’ADN sont chargés négativement. Placés dans un champ électrique, ils vont se déplacer de la cathode vers l’anode (l'analyse se fait par électrophorèse). Leur masse moléculaire va régler leur vitesse de déplacement à travers les mailles du gel dans lequel ils ont été placés. Plus les fragments sont petits, plus ils vont migrer rapidement et donc loin de leur point de départ. Ainsi, il sera possible de discriminer les deux allèles d’un individu (pourvu qu’ils soient de tailles différentes) et aussi distinguer deux individus différents s’ils possèdent des allèles séparés.

La technique PCR : comment ça marche ?

Le principe est de recopier un petit fragment d’ADN (de 100 à 250 paires de bases) en plusieurs millions d’exemplaires à partir de l’ADN génomique (l’ADN tout entier). En effet, l’ADN est trop grand pour pouvoir visualiser une mutation, il faut d’abord amplifier uniquement la région qui est à étudier. La PCR permet de recopier L’ADN grâce à une enzyme nommée Taq polymérase. L’ADN polymérase est résistante à la chaleur car elle est extraite d’une bactérie thermophile (Taq = Thermophilus Aquaticus). Thermophilus aquaticus, est une bactérie thermophile vivant à proximité des sources d'eaux chaudes (de 50 à 80 °C). Elle a été décrite par Thomas Brock en 1969 dans une source du parc de Yellowstone. Il faut bien sûr indiquer à l’ADN polymérase la région d’ADN qu’elle doit recopier un grand nombre de fois et pour cela il est nécessaire de connaître la séquence des régions qui flanquent l’ADN à amplifier. Ces séquences servent à définir des amorces (ou « oligonucléotides ») de 20 à 30 nucléotides qui serviront à fixer l’ADN polymérase. Pour être spécifiques (elles ne doivent pas se fixer n’importe où dans le génome mais seulement là où est présente la mutation), ces séquences sont choisie à l’aide d’un programme informatique. Une fois fixée, cette polymérase pourra recopier le fragment d’ADN d’intérêt. Cette réaction se passe dans un thermocycleur sous forme de 30 à 40 cycles successifs d’amplification. Le mix de PCR contient cette polymérase, les quatre nucléotides composant l’ADN (c’est à dire adénine, thymine, guanine, cytosine), un tampon qui maintient des conditions physiologiques normales de pH et optimise l’efficacité de l’enzyme.